پروتئین های مورفوژنتیک استخوانی (BMPs) متعلق به سوپرفامیلی فاکتور ترنسفورم کننده رشد بتا هستند. این مولکول ها در رشد و تکوین جنینی و همچنین تمایز سلول های مختلف نقش ایفا می کنند. در این خصوص دو مولکول همودایمر BMP-2 و BMP-7 نقش مهمی در تشکیل اکتوپیک استخوان دارند به طوری که دو نوع نوترکیب آن به صورت استفاده اکتوپیک در دسترس هستند. بعد از اتصال همودایمر BMP-2 به گیرنده خود در سطح سلول، تجمع همودایمرهای نوع I و II گیرنده آن منجر به ایجاد پاسخ بیولوژیک در داخل سلول می شود. علی رغم وجود انواع نوترکیب BMP-2 و BMP-7 به دلیل خطرات ناشی از استفاده از آنها هنوز استراتژی استفاده از انواع آندوژن از طریق به دام انداختن با آنتی بادی های مونوکلونال در محل ضایعه استخوانی در اولویت برنامه های تحقیقاتی است. روش جایگزین دیگر به جای استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال استفاده از گیرنده های طبیعی این لیگاند در بدن است. در این رابطه با توجه به Kd مناسب اتصال بخش اکتودمین گیرنده II مولکول BMP-2 در این پروژه اقدام به بیان و تخلیص این قسمت با هدف به دام انداختن BMP-2 اندوژن شد. قطعه پروتئینی اکتودمین گیرنده نوع II در میزبان باکتریایی بیان و تخلیص شد که با ارزیابی CD این پروتئین نوترکیب حاکی از ساختار مشابه با نوع طبیعی آن بود. همچنین ارزیابی اتصال آن به لیگاند BMP-2 با الایزا مورد بررسی قرار گرفت و در ادامه Kd آن محاسبه شد. براساس نتایج به دست آمده، بخش اکتودمین گیرنده نوع دو می تواند با ویژگی اتصال مناسب در غلظت نانومولار به BMP-2 متصل شود و در مطالعات بعدی می تواند به عنوان یک جایگزین به جای آنتی بادی مونوکلونال برای به دام اندازی مولکول های BMP آندوژن مورد استفاده قرار گیرد.

زمینه و هدف: ویبریو کلرا عامل بیماری کلرا در انسان می باشد. بیان فلاژل و تحرک باکتری در کلونیزاسیون و ویرولانس آن عامل بسیار مهمی است. ژن FlaA یکی از پنج ژن کد کننده فلاژلین می باشد که نقش اصلی در حرکت باکتری و کلونیزاسیون آن دارد و از نظر ایمنی بخشی نیز مورد توجه می باشد. در این مطالعه کلونینگ و بیان ژن FlaA در باکتری اشرشیاکلی و بیان پروتئین نوترکیب با روش وسترن بلات تائید می شود.مواد و روش ها: در این مطالعه تجربی، ژن flaA با پرایمرهای اختصاصی با PCR تکثیر و با آنزیم های BamHI و XhoI در وکتور pTZ57R/T کلون و در E.coli سویه DH5a تکثیر و تعیین توالی شد. در وکتور PGEX4T-1 و در E.coli سویه BL21-DE3 با القا IPTG بیان شد. از کیت G.S.T جهت خالص سازی پروتئین نوترکیب استفاده شد و پروتئین به موش تزریق و آنتی بادی اختصاصی سنتز شده در موش برای تایید نهایی پروتئین نوترکیب در وسترن بلات مورد استفاده گرفت.یافته ها: تعیین توالی نشان داد که ژن فوق بدرستی تکثیر شده است و آنتی بادی استفاده شده در وسترن بلات، تولید پروتئین نو ترکیب را نشان داد.نتیجه گیری: پروتئین نوترکیب flaA در میزبان E.coli با مقدار مناسب بیان گردید. تزریق پروتئین تولید شده به موش نشان داد که این پروتئین ضمن داشتن خاصیت آنتی ژنی به خوبی آن را حفظ می کند. بنابراین می توان از آن به عنوان یکی از اجزا موثر در طراحی یک واکسن ایمنی بخش و نیز به عنوان یک ابزار تشخیصی استفاد نمود.

بیماری بورس عفونی یا گامبورو، یکی از بیماری های ویروسی بسیار واگیر طیور است که در صنعت طیور در سراسر جهان باعث زیان های اقتصادی می شود. از آنجاییکه که پس از عفونت با ویروس بیماری بورس عفونی (IBDV) اولین آنتی بادی ها بر ضد پروتئین ساختمانی VP3 تولید می شوند، این پروتئین آنتی ژن مناسبی برای استفاده در الیزا میباشد. باتوجه به دشوار بودن تهیه VP3 طبیعی از IBDV یا سلول های آلوده به ویروس، VP3 نوترکیب بیان شده در اشرشیاکولی می تواند آنتی ژن مطلوبی برای این منظور محسوب شود.مطالعه حاضر با هدف کلونینگ ژن VP3 سویه ویروس واکسن D78 د ر پلاسمید pMal-C2X (یک پلاسمید بیانی پروکاریوتی) و بیان و خالص سازی پروتئین نوترکیب انجام گردید.بنابر این ژن VP3 با آزمایش RT-PCR تکثیر داده شده و پس از هضم با آنزیم های محدودگر مناسب در پلاسمید pMal-C2X کلون گردید. پس از تعیین توالی و اطمینان از کلونینگ موفق این ژن، بیان پروتئین نوترکیب با آزمایش SDS-PAGE تایید گردید. در ادامه پروتئین نوترکیب با استفاده از ستون کروماتوگرافی حاوی رزین آمیلوز خالص شد. بررسی واکنش پروتئین VP3 نوترکیب در آزمایش ایمونوبلاتینگ نشان داد که پروتئین تولید شده از نظر آنتی ژنی فعال می باشد. با توجه به راندمان بالای تولید در این سیستم، پروتئین بیان شده کاندیدای مناسبی برای طراحی آزمایش الیزا و سنجش تیتر آنتی بادی علیه ویروس بیماری بورس عفونی می باشد.

زمینه و هدف: یکی از پروتئین های مهم ویروس HIV-1 به نام Nef نقش مهمی در چرخه تکثیر ویروس و پیشرفت بیماری ایدز دارد و القای پاسخ ایمنی بر ضد آن می تواند تا حدی عفونت ویروسی را مهار نماید. به علاوه، بخشی از ناحیه پروتئین فعال کننده رونویسی (Tat، اسید آمینه های 48 تا 60) از ویروس HIV توانسته است به عنوان یک پپتید نفوذ کننده سلولی (CPP) عمل نماید. در این تحقیق، برای اولین باد کلونیگ و بیان فیوژن Tat-Nef در باکتری اشرشیاکلی صورت گرفت. تایید بیان پروتئین توسط آنالیز وسترن بلات و تخلیص آن از طریق روش رنگ آمیزی معکوس انجام شد.مواد و روش ها: در این مطالعه تجربی، ابتدا کلونینگ فیوژن Tat-Nef در وکتور بیانی pGEX6p2 صورت گرفت. سپس القای بیان پروتئین نو ترکیب Tat-Nef در باکتری اشرشیاکلی سویه BL21 (DE3) توسط القا کننده IPTG انجام شد. تایید بیان از طریق تکنیک SDS-PAGE و وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی منوکلونال ضد Nef صورت گرفت. سپس، تخلیص پروتئین فیوژن توسط تکنیک رنگ آمیزی معکوس از روی ژل انجام شد. یافته ها: نتایج آنالیز PCR و هضم آنزیمی، وجود باند واضح حدود 726 جفت باز را روی ژل آگارز تایید کرد که نشان گر کلونیگ صحیح فیوژن Tat-Nef در وکتور بیان پروکاریوتی pGEX6p2 بود. هم چنین، وجود باند پروتئینی حدود 54 کلیودالتون روی ژل SDS-PAGE نشان گر بیان پروتئین Tat-Nef بود که توسط آنتی بادی منوکلونال ضد Nef در آنالیز وسترن بلات تایید شد.نتیجه گیری: پروتئین فیوژن نو ترکیب Tat-Nef تخلیص شده به عنوان یک آنتی ژن برای طراحی واکسن پروتئینی در مقابل عفونت ویروس HIV استفاده خواهد شد.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (pdf) مراجعه فرمایید.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.

زمینه و هدف: پروتئین اریتروپویتین انسانی هورمونی گلیکوزیله با وزن مولکولی 40 کیلو دالتون است که در کلیه سنتز شده و در تکثیر و تمایز اریتروسیت ها نقش دارد. این پروتئین دارویی با نام تجاری «اپویتین» شناخته شده و کاربرد موثری در درمان آنمی، سرطان و عفونت های ناشی از HIV ایفاء می کند. این مطالعه به منظور ارزیابی استفاده از میزبان انگلی لیشمانیا تارانتولا (Leishmania tarentolae) به منظور تولید فرم نوترکیب اریتروپویتین انجام شد.روش بررسی: در این مطالعه توصیفی ژن اریتروپویتین پس از بهینه سازی کدون توسط پایگاه های بیوانفورماتیکی سنتز شد و توسط استراتژی برش با آنزیم های KpnI و XbaI و خالص سازی از روی ژل در وکتور بیانی pLEXSY کلون گردید. سازه بیانی ساخته شده با روش الکتروپوریشن به لیشمانیا تارانتولا ترانسفکت شد. شناسایی و تایید کلونی های انگل ترانسفکت شده با سازه ژنی با استفاده از روش PCR با پرایمرهای تشخیصی سازه بیانی و پرایمرهای مخصوص اریتروپویتین انجام گرفت. ژن اریتروپویتین کلون شده توسط تتراسایکلین القاء گردید و بیان ژن در سوش های القاء شده با تکنیک SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ آنالیز شد. تعیین مقدار پروتئین نوترکیب تولید شده نیز با روش ELISA انجام شد. سازه بیانی اریتروپویتین برای کلونینگ و بیان در میزیان لیشمانیا تارانتولا توسط روش های مهندسی ژنتیک تایید شد.یافته ها: نتایج آنالیز بیان ژن در سوش انگل ترانسفکت شده توسط الکتروفورز SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ تایید کننده ورود سازه ژنی به کروموزم انگل و بیان اریتروپویتین بودند. بهترین شرایط بیان پروتئین نوترکیب، 10 میکروگرم تتراسایکلین و زمان القاء 72 ساعت بود. وزن مولکولی پروتئین بیان شده 40 کیلو دالتون تخمین زده شد و میزان بیان آن نیز 12.4 میلی گرم در لیتر معادل با یک درصد کل پروتئین سلول تعیین گردید.نتیجه گیری: سازه بیانی برای کلونینگ و بیان ژن اریتروپویتین در لیشمانیا تارانتولا طراحی و ساخته شد و پروتئین مذکور با موفقیت القاء و شناسایی گردید. لیشمانیا تارانتولا می تواند به عنوان میزبان مناسب در تولید اریتروپویتین نوترکیب مورد استفاده قرار گیرد و این فناوری قابلیت بومی سازی نیز دارد.